免疫熒光技術是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原（或抗體）。在組織或細胞內形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。
很多新手在著手免疫熒光實驗時會遇到各種各樣的問題，從而不能得到理想的實驗結果。下面小編為大家總計了幾點試驗需要注意的方面：
1.合適的細胞密度
首先細胞密度是試驗成功的前提，細胞密度太大，會造成細胞過于擁擠而邊界不清晰，不僅細胞形態(tài)不佳且易導致染色背景深。同理細胞過少時不僅容易貼壁不好觀察時不好找細胞，而且由于細胞過少可能活性不佳從而易發(fā)生非特異性熒光染色。不管是用六孔板還是共聚焦皿細胞密度以達到75%-85%為佳。
2.細胞固定和通透
固定劑的選擇依賴于抗原的亞細胞定位（膜蛋白，可溶，細胞骨架相關蛋白等）。3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛是常用的固定劑，適用于絕大多數(shù)蛋白。如果是研究膜蛋白的話，用3.7%-4%的甲醛。而研究細胞骨架成分可用甲醇固定法。固定后一般需要通透步驟，通透即是在膜上打孔，讓抗體更易進入細胞與抗原結合。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。通透一般可以用0.1%-0.2%的Triton-X100，而選擇甲醇固定一般無需再通透，甲醇本身就有通透的作用。
3.封閉條件的優(yōu)化選擇
為了防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前用封閉液封閉，這樣可以減少非特異性的背景著色。封閉液可以選擇二抗來源一致的血清，一般來說，血清價格比較昂貴，可以用1%-5%BSA替代，BSA可以說是萬能的封閉血清。另外封閉時間不易過長，30-60min即可，且封閉后不用洗滌，直接加一抗孵育即可。
4.一抗二抗的選擇
封閉過后需要一抗孵育，可以選擇4度過夜孵育或者室溫3h，以筆者的經驗是一抗孵育4度過夜比較好，抗原抗體結合會比較充分。一抗二抗的稀釋比例可以根據抗體說明書來，再根據自己具體的實驗要求進行優(yōu)化。如果抗體濃度過低，會造成信號太弱，如果抗體濃度過高可能會造成背景染色太強。熒光二抗個人感覺Alexflour熒光基團信號強于Dylight強于FITC。如果做免疫雙標，一抗要來自不同種屬，熒光二抗的光譜也要分開。
5.洗滌步驟
免疫熒光過程中，有很多洗滌步驟，用PBS即可。在洗滌過程中，一要注意動作輕柔，固定后的細胞比較脆弱，如果太過大力，很容易把細胞吹洗掉，二是洗滌時間要把握好，每次洗滌5min左右，三是切忌不要干片，即吸掉溶液后不要把細胞干著，不然容易造成背景著色。
