RIP技術主要是運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，經(jīng)過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行q-PCR驗證或者測序分析。RIP是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結合情況的技術，是了解轉錄后調(diào)控網(wǎng)絡動態(tài)過程的有力工具，可以幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。根據(jù)需求，金開瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作驗證RIP技術服務。
應用：
1.用抗體或表位標記物捕獲細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結合蛋白；
2.防止非特異性的RNA的結合；
3.免疫沉淀把RNA結合蛋白及其結合的RNA一起分離出來；
4.結合的RNA序列通過定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。
RIP實驗流程：
(一)細胞裂解液獲取
A.單層細胞或者貼壁細胞處理
1.冷PBS清洗培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細胞兩次
2.加入冷PBS后用細胞刮將細胞刮下來，收集至enpendoff管
3.1500rpm，4℃離心5min，棄上清，收集細胞
4.用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞，吹打均勻后于冰上靜置5min
5.每管分裝200ul細胞裂解液，貯存于-80℃
B.懸浮細胞處理：先收集細胞再計數(shù)，然后清洗裂解
C.組織樣品處理
1.冷PBS清洗新鮮切下的組織三次
2.加入冷PBS后，用勻漿器或其他細胞分離設備使組織分散為單個細胞，計數(shù)
3.1500rpm，4℃離心5min，棄上清，收集細胞
4.用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞，吹打均勻后置于冰上靜置5min
5.每管分裝200ul細胞裂解液，貯存于-80℃
(二)磁珠的準備
A.實驗前準備
1、enpendoff管
2、磁力架
3、冰盒，RIPWashBuffer置于冰上
4、抗體，置于冰上
5、渦旋震蕩器
6、槍、槍頭放于超凈臺照射30min，槍噴DEPC水
B.磁珠準備過程
1.重懸磁珠
2.標記實驗所需的enpendoff管，樣品包括目的樣品，陰性對照與陽性對照
3.吸取50ul重懸后的磁珠懸液于每個enpendoff管
4.每管加入500ulRIPWashBuffer，渦旋震蕩
5.將enpendoff管置于磁力架上，并左右轉動15°使磁珠吸附成一條直線，去上清，重復一次
6.用100ul的RIPWashBuffer重懸磁珠，加入約5ug相應抗體于每個樣品中
7.室溫孵育30min
8.將enpendoff管置于磁力架上，棄上清
9.加入500ulRIPWashBuffer，渦旋震蕩后棄上清，重復一次
10.加入500ulRIPWashBuffer，渦旋震蕩后置于冰上
